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單細胞凝膠電泳實驗（彗星實驗?）的應(yīng)用與試驗基本步驟

來源：時間：2025-06-17 17:28:02 瀏覽：4345次

單細胞凝膠電泳實驗（彗星實驗）的應(yīng)用與試驗基本步驟

彗星實驗（Comet Assay），又稱單細胞凝膠電泳實驗（Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE），是一種在單細胞水平上檢測DNA損傷的靈敏技術(shù)。該技術(shù)由?stling和Johanson于1984年首次提出，后經(jīng)Singh等人改進，現(xiàn)已成為遺傳毒理學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域的重要工具。

彗星實驗

彗星實驗的作用

檢測DNA損傷：評估細胞在各種條件下（如化學(xué)物質(zhì)、輻射、環(huán)境污染物等）的DNA損傷程度

研究DNA修復(fù)機制：通過時間序列實驗觀察DNA損傷后的修復(fù)過程

評估遺傳毒性：用于藥物開發(fā)、化妝品安全評估等領(lǐng)域的遺傳毒性測試

環(huán)境監(jiān)測：評估環(huán)境污染物對生物體的遺傳毒性影響

臨床研究：研究疾?。ㄈ绨┌Y）與DNA損傷的關(guān)系

彗星實驗的基本步驟

1. 樣品制備

收集待測細胞（可以是培養(yǎng)細胞、血液淋巴細胞、組織細胞等）

制備單細胞懸液（濃度約1×10? cells/mL）

細胞活力檢測（建議>80%）

2. 包埋

將細胞與低熔點瓊脂糖（0.5-1%）混合

滴加在預(yù)先涂有普通瓊脂糖的載玻片上

蓋上蓋玻片，4℃固化5-10分鐘

3. 裂解

去除蓋玻片，將載玻片浸入裂解液（含2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, 1% Triton X-100, pH 10）

4℃裂解1-2小時（或過夜）

4. 解旋

將載玻片置于堿性緩沖液（300mM NaOH, 1mM EDTA, pH>13）中

室溫解旋20-40分鐘，使DNA雙鏈解旋并暴露損傷位點

5. 電泳

在相同堿性緩沖液中進行電泳

條件通常為：25V，300mA，20-30分鐘（具體參數(shù)需優(yōu)化）

電泳槽需保持4℃以維持DNA結(jié)構(gòu)

6. 中和與染色

用中和緩沖液（0.4M Tris-HCl, pH 7.5）中和2-3次，每次5分鐘

用熒光染料（如EB、SYBR Green等）染色

避光保存待觀察

7. 觀察與分析

在熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長與所用染料匹配）

每樣品至少觀察50-100個細胞

使用專業(yè)軟件（如CASP、CometScore等）分析彗星參數(shù)：

尾長（Tail Length）

尾矩（Tail Moment）

尾DNA百分比（% Tail DNA）

彗星實驗的步驟

彗星實驗雖然原理簡單，但實際操作中需要精細的技術(shù)控制和豐富的經(jīng)驗積累。對于科研人員來說，如果時間有限或缺乏相關(guān)實驗條件，選擇專業(yè)的科研服務(wù)機構(gòu)是一個高效可靠的選擇。

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專業(yè)技術(shù)團隊：由經(jīng)驗豐富的實驗技術(shù)人員操作

標(biāo)準(zhǔn)化流程：確保實驗結(jié)果的可靠性和重復(fù)性

多種檢測方案：可根據(jù)需求提供堿性、中性或酶修飾彗星實驗

全面數(shù)據(jù)分析：提供專業(yè)軟件分析的詳細報告

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