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?細(xì)胞熱遷移分析技術(shù)cetsa的具體原理和實驗流程

來源：時間：2024-11-29 11:29:19 瀏覽：21459次

?細(xì)胞熱遷移分析技術(shù)cetsa的具體原理和實驗流程

一、基本原理

細(xì)胞熱遷移分析技術(shù)（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是一種用于檢測細(xì)胞內(nèi)藥物與靶蛋白結(jié)合效率的實驗技術(shù)，其基本原理是基于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性；在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)藥物與靶蛋白結(jié)合時，靶蛋白的結(jié)構(gòu)會變得更加穩(wěn)定，從而在升高的溫度下不易發(fā)生變性，因此，與未結(jié)合藥物的蛋白相比，結(jié)合了藥物的蛋白在相同的溫度下會有更多的未降解蛋白；這一現(xiàn)象可以通過測量不同溫度下的蛋白降解情況來觀察，通常使用免疫印跡（Western blotting）或質(zhì)譜（MS）等方法進(jìn)行檢測。

二、實驗流程

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

細(xì)胞培養(yǎng)：選擇合適的細(xì)胞系，如HEK 293T細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)；確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。

轉(zhuǎn)染：如果需要，將構(gòu)建好的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，以便在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特定的蛋白；通常使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按照制造商的方案進(jìn)行操作。

藥物處理：將細(xì)胞暴露于DMSO（對照組）或待測試的藥物中，孵育一定時間（例如24小時），以確保藥物充分與靶蛋白結(jié)合。

2. 細(xì)胞裂解

洗滌：收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑（如1 mmol/L PMSF或50×cocktail）的PBS洗滌細(xì)胞，以防止蛋白降解。

重懸：將細(xì)胞重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度至2×10^7 cells/ml。

3. 溫度梯度處理

分裝：將細(xì)胞分裝到多個PCR管中，每管含有相同數(shù)量的細(xì)胞。

加熱：將PCR管置于熱循環(huán)器中，在不同的溫度（例如37℃至67℃）下加熱3分鐘，使蛋白質(zhì)變性；每個溫度點設(shè)置至少三個重復(fù)樣本，以確保結(jié)果的可靠性。

4. 細(xì)胞裂解和凍融

裂解：將加熱后的細(xì)胞重懸于NP40緩沖液中，用液氮進(jìn)行3次凍融循環(huán)，以徹底裂解細(xì)胞。

離心：將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、20,000×g離心20分鐘，收集上清液；上清液中含有未降解的蛋白，而沉淀物中則是已經(jīng)降解的蛋白。

5. 蛋白檢測

Western blotting：取20 μL上清液，加入等量的2×SDS loading buffer，沸水浴中滅活10分鐘；然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡，檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

質(zhì)譜分析：如果需要進(jìn)行高通量檢測，可以將上清液送至質(zhì)譜公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，以獲得更詳細(xì)的蛋白信息。

三、應(yīng)用

1. 藥物靶點驗證

藥物結(jié)合：CETSA可以驗證藥物是否與預(yù)期的靶蛋白結(jié)合，通過比較藥物處理組和對照組的蛋白降解情況，可以確定藥物與靶蛋白的結(jié)合效率。

脫靶效應(yīng)：CETSA還可以用于檢測藥物的脫靶效應(yīng)，即藥物是否與非預(yù)期的蛋白結(jié)合；這有助于評估藥物的安全性和特異性。

2. 蛋白-蛋白相互作用

相互作用驗證：CETSA可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白-蛋白相互作用，通過觀察不同溫度下蛋白的降解情況，可以判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用。

相互作用強度：CETSA還可以提供關(guān)于蛋白-蛋白相互作用強度的信息，這對于理解生物過程中的調(diào)控機制非常重要。

3. 藥物篩選

高通量篩選：結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)（MS-CETSA），CETSA可以用于高通量篩選潛在的藥物候選物；通過大規(guī)模的溫度梯度實驗，可以快速鑒定出與目標(biāo)蛋白結(jié)合的化合物。

四、局限性

盡管CETSA技術(shù)具有許多優(yōu)點，但也存在一些局限性：

靈敏度：并非所有蛋白-蛋白相互作用都會產(chǎn)生明顯的CETSA位移，因此某些相互作用可能難以檢測。

結(jié)構(gòu)信息：CETSA通常無法提供具體的結(jié)構(gòu)信息，特別是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)存在多個相互作用對象時。

細(xì)胞定位：CETSA無法直接提供藥物在細(xì)胞內(nèi)的具體定位信息，需要結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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