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生物樣本透射電鏡測(cè)試的各類樣品制備方法
來(lái)源: 時(shí)間:2024-11-05 10:52:15 瀏覽:5928次

生物樣本透射電鏡測(cè)試的各類樣品制備方法

 

生物樣本透射電鏡(Transmission Electron Microscopy,簡(jiǎn)稱TEM是一種利用電子束穿透樣品進(jìn)行成像和分析的顯微技術(shù),具有極高的分辨率,能夠觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)、病毒、蛋白質(zhì)等生物樣品的納米級(jí)細(xì)節(jié)為了獲得高質(zhì)量的TEM圖像,樣品的制備至關(guān)重要。

一、概述

透射電鏡樣品制備的基本目標(biāo)是保持生物樣品的自然狀態(tài),同時(shí)提高樣品的電子透明度,以便電子束能夠穿透并產(chǎn)生清晰的圖像;制備過(guò)程通常包括固定、脫水、滲透、包埋、切片、染色和安裝等步驟。

二、樣品制備方法

(一)固定

固定是樣品制備的第一步,目的是迅速殺死細(xì)胞,并盡可能保持其生前狀態(tài);常用的固定劑有戊二醛和鋨酸,戊二醛能快速穿透細(xì)胞,固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,而鋨酸則固定細(xì)胞核和細(xì)胞器。

1. 戊二醛固定:將樣品置于2.5%的戊二醛溶液中,4℃下固定數(shù)小時(shí)至過(guò)夜。

2. 鋨酸固定:戊二醛固定后,用鋨酸進(jìn)行后固定,通常在4℃下進(jìn)行1-2小時(shí)。

(二)脫水

脫水是為了去除細(xì)胞中的水分,以便后續(xù)的滲透和包埋。常用的脫水劑有乙醇和丙酮,濃度從30%逐漸增加到100%。

(三)滲透

滲透是將脫水劑替換為能與包埋劑相容的溶劑,如環(huán)氧樹脂,使包埋劑能夠滲透到細(xì)胞內(nèi)部。

(四)包埋

包埋是將樣品嵌入到固體介質(zhì)中,以便進(jìn)行切片。常用的包埋劑有環(huán)氧樹脂、聚酯樹脂等。

(五)切片

切片是將包埋好的樣品切割成超?。ㄍǔ?/span>50-100納米)的切片,以供TEM觀察。切片方法有超薄切片和冷凍切片等。

1. 超薄切片:使用超薄切片機(jī),如萊卡UC6或鉆石刀,獲得超薄切片。

2. 冷凍切片:在冷凍狀態(tài)下,使用冷凍切片機(jī)切割樣品。

(六)染色

染色是為了增強(qiáng)樣品的對(duì)比度,使其在TEM下更容易觀察。常用的染色劑有醋酸鈾、檸檬酸鉛等。

(七)安裝

將染色后的切片安裝在TEM專用的銅網(wǎng)或微柵上,準(zhǔn)備進(jìn)行TEM觀察。

三、特殊樣品制備方法

1. 細(xì)胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的標(biāo)記:對(duì)于需要觀察細(xì)胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的情況,可以使用免疫金標(biāo)記、免疫電子顯微鏡技術(shù)等對(duì)目標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記。

2. 原位雜交:原位雜交技術(shù)可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定的RNADNA序列,結(jié)合TEM技術(shù),可以觀察到特定序列在細(xì)胞內(nèi)的分布。

3. 冷凍斷裂技術(shù):冷凍斷裂技術(shù)適用于研究細(xì)胞膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。樣品在冷凍狀態(tài)下斷裂,暴露出細(xì)胞膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu),然后進(jìn)行TEM觀察。

四、注意事項(xiàng)

1. 在整個(gè)制備過(guò)程中,要盡量減少對(duì)樣品的損傷,保持其原始結(jié)構(gòu)。

2. 確保固定、脫水、滲透、包埋等步驟的試劑和設(shè)備清潔,避免污染。

3. 切片時(shí)要保證切片的厚度均勻,以便獲得高質(zhì)量的TEM圖像。

4. 染色過(guò)程中要控制染色時(shí)間,避免過(guò)度染色。

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文字是人類用符號(hào)記錄表達(dá)信息以傳之久遠(yuǎn)的方式和工具?,F(xiàn)代文字大多是記錄語(yǔ)言的工具。人類往往先有口頭的語(yǔ)言后產(chǎn)生書面文字,很多小語(yǔ)種,有語(yǔ)言但沒(méi)有文字。文字的不同體現(xiàn)了國(guó)家和民族的書面表達(dá)的方式和思維不同。文字使人類進(jìn)入有歷史記錄的文明社會(huì)。
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