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冷凍電鏡Cryo-TEM詳解:樣品冷凍與成像原理
來(lái)源: 時(shí)間:2024-08-02 09:55:41 瀏覽:9240次

冷凍電鏡Cryo-TEM詳解:樣品冷凍與成像原理

 

冷凍電鏡(Cryo-TEM)技術(shù)是一種能夠在低溫條件下對(duì)生物樣品進(jìn)行成像的電子顯微技術(shù)。近年來(lái),隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,冷凍電鏡在生物科學(xué)研究領(lǐng)域取得了重大突破,為解析生物大分子結(jié)構(gòu)提供了強(qiáng)有力的手段。

一、樣品冷凍原理

1. 快速冷凍技術(shù)

冷凍電鏡的核心在于快速冷凍技術(shù),它能將生物樣品迅速冷卻至液氮溫度(-196℃),使樣品中的水分子形成非晶態(tài)冰,從而保持生物樣品在近生理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)??焖倮鋬黾夹g(shù)主要包括以下兩種方法:

1)高壓冷凍:將樣品置于高壓環(huán)境中,使水分子在冷凍過(guò)程中不易形成冰晶。這種方法適用于細(xì)胞、組織等較大體積的生物樣品。

2)滴注冷凍:將樣品溶液滴注到冷凍載體上,如銅網(wǎng)格或微柵,然后迅速冷凍。這種方法適用于蛋白質(zhì)、病毒等較小體積的生物樣品。

2. 冷凍過(guò)程

冷凍電鏡的冷凍過(guò)程主要包括以下幾個(gè)步驟:

1)樣品制備:將生物樣品稀釋至適當(dāng)濃度,并添加冷凍保護(hù)劑(如甘油、乙二醇等)以降低冰晶形成的可能性。

2)滴注樣品:將樣品溶液滴注到冷凍載體上,形成薄層。

3)快速冷凍:采用高壓冷凍或滴注冷凍方法,使樣品迅速冷卻至液氮溫度。

4)冷凍樣品轉(zhuǎn)移:將冷凍后的樣品轉(zhuǎn)移到冷凍傳輸裝置,如冷凍傳輸桿,以便在低溫條件下進(jìn)行電鏡觀察。

二、成像原理

1. 電子束與樣品相互作用

冷凍電鏡采用高能電子束對(duì)冷凍樣品進(jìn)行照射,電子束與樣品中的原子發(fā)生相互作用,產(chǎn)生信號(hào)。這些信號(hào)包括透射電子、彈性散射電子、非彈性散射電子等。其中,透射電子攜帶了樣品的結(jié)構(gòu)信息,是成像的主要信號(hào)。

2. 成像模式

冷凍電鏡的成像模式主要包括以下幾種:

1)透射電子顯微鏡(TEM)模式:通過(guò)檢測(cè)透射電子,獲得樣品的二維圖像。在冷凍電鏡中,TEM模式主要用于觀察樣品的整體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

2)掃描透射電子顯微鏡(STEM)模式:利用聚焦電子束掃描樣品,獲得樣品的元素分布信息。STEM模式在冷凍電鏡中可用于分析樣品的化學(xué)成分。

3)低劑量成像:為了減少電子束對(duì)樣品的損傷,冷凍電鏡采用低劑量成像技術(shù)。通過(guò)降低電子束的劑量,延長(zhǎng)樣品在電子束下的壽命,從而獲得高質(zhì)量的圖像。

3. 圖像處理與分析

冷凍電鏡獲得的原始圖像需要經(jīng)過(guò)一系列處理和分析,才能提取出有用的結(jié)構(gòu)信息。主要包括以下步驟:

1)圖像校正:消除圖像中的畸變、失真等,提高圖像質(zhì)量。

2)圖像分割:將圖像中的目標(biāo)物體與背景分離,便于后續(xù)分析。

3)三維重建:根據(jù)二維圖像,采用計(jì)算機(jī)算法重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。

4)結(jié)構(gòu)解析:對(duì)重建的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,揭示生物大分子的空間構(gòu)象和相互作用。

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