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WB實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)膜與抗體結(jié)合步驟詳解
來源： 時(shí)間：2024-01-08 09:59:01 瀏覽：5473次

WB實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)膜與抗體結(jié)合步驟詳解

 

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平和分子量的技術(shù)，WB實(shí)驗(yàn)包括樣品制備、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色等多個(gè)步驟。


一、轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜是將SDS-PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定在固相支持物上的過程，轉(zhuǎn)膜方法有向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、向下毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移等；固相支持物主要有硝酸纖維素膜和尼龍膜，硝酸纖維素膜是非共價(jià)結(jié)合，易脆，而尼龍膜是帶正電荷的，高強(qiáng)度，不易破損，具有較大的DNA結(jié)合容量，在轉(zhuǎn)膜過程中，需要將分離膠上的蛋白質(zhì)完全轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)的抗體結(jié)合和檢測(cè)。

二、抗體結(jié)合

抗體結(jié)合是WB實(shí)驗(yàn)的核心步驟，主要包括一抗孵育、洗滌、二抗孵育和洗滌等過程。

1. 一抗孵育：將特異性一抗添加到轉(zhuǎn)膜后的膜上，孵育過程中一抗與目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，一抗的濃度和孵育時(shí)間需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整；一般情況下，一抗的濃度在1:1000-1:10000之間，孵育時(shí)間為1-2小時(shí)，在孵育過程中，需要保持膜的濕潤(rùn)，可以使用封閉液或抗體稀釋液進(jìn)行濕潤(rùn)。

2. 洗滌：用緩沖液（如TBST）反復(fù)洗滌膜上未結(jié)合的一抗，洗滌的次數(shù)和時(shí)間需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整，一般洗滌3-5次，每次5-10分鐘；洗滌的目的是去除未結(jié)合的一抗，避免后續(xù)的顯色反應(yīng)受到干擾。

3. 二抗孵育：將與一抗匹配的二抗加入到膜上，孵育過程中二抗與一抗結(jié)合，二抗的濃度和孵育時(shí)間也需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整；一般情況下，二抗的濃度在1:1000-1:10000之間，孵育時(shí)間為1-2小時(shí)，同樣需要保持膜的濕潤(rùn)。

4. 洗滌：用緩沖液（如TBST）反復(fù)洗滌膜上未結(jié)合的二抗；洗滌的次數(shù)和時(shí)間需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整，一般洗滌3-5次，每次5-10分鐘。

三、注意事項(xiàng)

1. 在轉(zhuǎn)膜過程中，需要控制好轉(zhuǎn)膜電壓和時(shí)間，以及膜的濕度和尺寸，避免影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效率。

2. 在抗體結(jié)合過程中，需要注意一抗和二抗的濃度和孵育時(shí)間，避免過度或不足結(jié)合。

3. 洗滌步驟是去除未結(jié)合抗體的重要環(huán)節(jié)，需要充分洗滌，避免背景雜亂。

4. 實(shí)驗(yàn)過程中需要保持膜的濕潤(rùn)，避免膜干燥影響抗體結(jié)合。

5. 在顯色過程中，需要均勻涂抹ECL顯色液，避免顯色不均。

 

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