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Nature Cell Biology | 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)RNA成像技術(shù)

來源：時(shí)間：2022-12-27 10:46:03 瀏覽：7482次

研究RNA成像技術(shù)的原因是什么呢？眾所周知，從DNA到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變是以RNA為中心的一個(gè)復(fù)雜的、多階段的過程，轉(zhuǎn)錄后，RNA分子開始進(jìn)行剪接、定位、翻譯和降解，這些步驟在空間和時(shí)間領(lǐng)域中都是高度協(xié)調(diào)和嚴(yán)格調(diào)控的，細(xì)胞內(nèi)RNA的可視化技術(shù)能夠幫助我們更加深入地研究代謝的過程。近期，美國加州大學(xué)圣地亞哥分校華裔科學(xué)家Gene W. Yeo在Nature cell biology 雜志上發(fā)表了一篇名為“Illuminating RNA biology through imaging”的綜述文章，他帶領(lǐng)我們回顧了RNA成像的發(fā)展歷程以及各種成像技術(shù)在RNA代謝中的作用，并對(duì)RNA成像的趨勢進(jìn)行了討論與展望。

RNA成像技術(shù)在固定細(xì)胞和活細(xì)胞中都在快速發(fā)展。在固定細(xì)胞中，目前的方法已經(jīng)取得了高通量的成像，并能夠定位和定量整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平；在活細(xì)胞中，成像是低通量的，這個(gè)限制是由于每種顏色只能對(duì)應(yīng)一種基因，但活細(xì)胞RNA成像的優(yōu)勢是通過成像分辨率的提高能夠加深我們對(duì)RNA代謝動(dòng)態(tài)的理解。
在固定細(xì)胞中，對(duì)于單分子的RNA成像，包括熒光原位雜交（FISH），滾環(huán)擴(kuò)增（RCA-FISH），RNAscope，雜交鏈反應(yīng)(HCR)-FISH和交換反應(yīng)(saber)-FISH。1982年，Singer和Ward，通過結(jié)合的肌動(dòng)蛋白信使RNA(mRNA)與2‘-脫氧尿苷-5’-三磷酸(dUTP)的DNA探針結(jié)合，首次證明了熒光原位雜交(FISH)。1998年，利用互補(bǔ)DNA(cDNA)寡核苷酸合成了單分子FISH(smFISH)。2008年，該方法被進(jìn)一步改進(jìn)，通過用48個(gè)DNA探針探測每個(gè)mRNA，每個(gè)探針都標(biāo)記為單熒光色素，以單分子分辨率檢測mRNA。滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)-FISH的原理是先雜交并將掛鎖探針連接到特定的mRNA靶點(diǎn)，然后擴(kuò)增掛鎖探針。
在smFISH和RCA-FISH的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高檢測效率，提高亮度，降低總體成本。各個(gè)科研團(tuán)隊(duì)陸續(xù)開發(fā)了RNAscope，雜交鏈反應(yīng)(HCR)-FISH和交換反應(yīng)(saber)-FISH。RNAscope利用了多個(gè)平行的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)DNA寡核苷酸探針。雜交鏈反應(yīng)(HCR)-FISH8和交換反應(yīng)(saber)-FISH9分別用發(fā)夾探針和串聯(lián)體放大初級(jí)探針，再沿初級(jí)探針鋪設(shè)熒光二級(jí)探針。
在固定細(xì)胞中，對(duì)于多路RNA成像，主要包括組合FISH和原位測序。組合FISH為每個(gè)獨(dú)特的RNA目標(biāo)分配一個(gè)“光譜條形碼”，條形碼中的每個(gè)位在特定的一輪成像中對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定的熒光色素，增加條形碼中的位數(shù)，可以指數(shù)級(jí)地增加可以檢測到的唯一轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，MERFISH和seqFISH的后續(xù)開發(fā)都能夠檢測到10000個(gè)獨(dú)特的RNA靶點(diǎn)。2013年，原位測序(ISS)技術(shù)利用RCA-FISH和連接測序(SBL)來擴(kuò)增和讀取條形碼，并確定靶mRNA的位置。隨著探針設(shè)計(jì)的改進(jìn)，導(dǎo)致了一個(gè)新的條形碼系統(tǒng)——基于雜交的ISS(HybISS)，這種新方法改進(jìn)了RNA轉(zhuǎn)錄的空間檢測。熒光原位RNA測序(FISSEQ)嘗試對(duì)所有RNA進(jìn)行無偏不倚的單分子測量。FISSEQ不是與掛鎖探針雜交，而是與隨機(jī)六聚體引物雜交。在多路RNA成像方法中，一個(gè)很有前景的新思路是使用在空間條形碼載玻片上捕獲的RNA。例如，最近開發(fā)的Seq-Scope利用下一代測序(NGS)化學(xué)，從捕獲的RNA中生成簇僅為0.5-0.8μm。

表1.目前固定細(xì)胞中RNA成像方法的比較

活細(xì)胞中RNA的成像分為外源性成像和內(nèi)源性成像。活細(xì)胞的外源性成像包括熒光標(biāo)記的RNA，RNA莖環(huán)系統(tǒng)和熒光生成的RNA三類技術(shù)。1997年，Glotzer和他的同事將熒光標(biāo)記的RNA微注射到果蠅卵母細(xì)胞中，以研究其短程和長程運(yùn)輸。1998年，Singer和他的同事開發(fā)了RNA莖環(huán)系統(tǒng)，以可視化釀酒酵母中定位于芽尖的ASH1mRNA。該系統(tǒng)由兩個(gè)質(zhì)粒組成，其中一個(gè)質(zhì)粒編碼一種綠色熒光蛋白(GFP)，與單鏈RNA噬菌體衣殼蛋白MS2的編碼序列融合，也稱為MS2外殼蛋白(MCP)。第二個(gè)質(zhì)粒表達(dá)一個(gè)報(bào)告基因RNA，其中包含一個(gè)目標(biāo)蛋白的編碼序列，然后是6個(gè)MS2結(jié)合位點(diǎn)(MBSs)。除MS2外，還出現(xiàn)了其他RNA莖環(huán)系統(tǒng)，包括PP7、λN、U1A和BglG。在這些系統(tǒng)中，莖環(huán)的長度從15到29個(gè)核苷酸不等，其蛋白質(zhì)結(jié)合伙伴的大小從22到129個(gè)氨基酸，MS2/PP7系統(tǒng)相對(duì)抗光漂白，MS2系統(tǒng)可以通過基因整合到內(nèi)源性基因中，以研究活鼠腦組織中的mRNA動(dòng)態(tài)。2011年，Jaffrey和同事報(bào)道了一種模仿GFP的RNA適配體。在GFP中，這三個(gè)殘基Ser65-Tyr66-Gly67形成了一個(gè)熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)，4-羥基苯甲基咪唑啉酮(HBI)?；谶@一原理，作者通過指數(shù)富集(SELEX)對(duì)配體進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)了一種RNA適配體，它可以包裹HBI，導(dǎo)致熒光。這三種方法是最早在活細(xì)胞中可視化RNA的方法之一，并闡明了RNA生物學(xué)的多個(gè)方面，但這些系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)是無法成像內(nèi)源性的、非轉(zhuǎn)基因的mRNA。
活細(xì)胞的內(nèi)源性成像包括化學(xué)合成探針和基因編碼的探針。1996年，Tyagi和Kramer發(fā)明了一種名為“分子信標(biāo)”的單鏈寡核苷酸探針，雜交后在目標(biāo)RNA時(shí)發(fā)出熒光，這就是分子信標(biāo)探針。另一種可視化內(nèi)源性RNA的系統(tǒng)涉及在RNA合成過程中將熒光標(biāo)記的dUTP合并到RNA中，該系統(tǒng)的一個(gè)局限性是因?yàn)闊晒鈽?biāo)記的dUTP可以整合到任何RNA中，所以它不能跟蹤特定的RNA。關(guān)于基因編碼探針，2016年，作者的實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)證明，通過RCas9與GFP融合，在活細(xì)胞中的RNA跟蹤是可能的。2017年，Zhang和他的同事證明了Cas13a可以被設(shè)計(jì)成靶向哺乳動(dòng)物RNA，并展示了催化活性Cas13a(dCas13a)與GFP融合的活細(xì)胞RNA成像。圖1.亞細(xì)胞RNA成像技術(shù)發(fā)展史

RNA成像技術(shù)的進(jìn)展增加了我們對(duì)RNA整個(gè)功能生命周期（轉(zhuǎn)錄、剪接、定位、翻譯和降解）的理解。在轉(zhuǎn)錄階段，使用MS2系統(tǒng)的活細(xì)胞RNA成像可以檢測多種轉(zhuǎn)錄特性，亞細(xì)胞RNA成像不僅可以回答轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵問題，并且轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)活細(xì)胞RNA成像的技術(shù)可以促進(jìn)我們理解轉(zhuǎn)錄機(jī)制。在剪接階段，從時(shí)間尺度上，剪接的時(shí)間在20秒到幾分鐘不等，RNA的剪接是選擇性剪接，將其進(jìn)行成像，可以有助于理解選擇性剪接在亞細(xì)胞定位中的精確作用。在定位階段，RNA定位錯(cuò)誤與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，轉(zhuǎn)錄組測序研究已經(jīng)確定了這些定位錯(cuò)誤的mRNA。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和活細(xì)胞RNA成像的出現(xiàn)使我們有了在更高的空間和時(shí)間分辨率下研究mRNA錯(cuò)誤定位的能力。在翻譯階段，活細(xì)胞成像可以理解翻譯的時(shí)間動(dòng)態(tài)，而固定細(xì)胞RNA成像可以在更廣泛的范圍內(nèi)研究翻譯動(dòng)態(tài)。結(jié)合smFISH和o-丙炔-嘌呤霉素的新生蛋白染色顯示，腸上皮細(xì)胞的整體mRNA定位發(fā)生極化，導(dǎo)致翻譯效率的極化。在降解階段，降解被認(rèn)為是一種誘導(dǎo)和維持RNA定位的機(jī)制。在rnp中運(yùn)輸?shù)膍RNA通常被保護(hù)不降解，確保正確傳遞到目的地。未來具有高時(shí)空分辨率的研究工具將有助于闡明RNA降解和定位之間的相互作用。圖2.RNA成像技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域帶來的多個(gè)亮點(diǎn)

隨著固定細(xì)胞的mRNA成像已經(jīng)從單一靶點(diǎn)發(fā)展到轉(zhuǎn)錄組規(guī)模，成像速度和圖像分析仍然是亞細(xì)胞mRNA定位研究的瓶頸。人工智能在自動(dòng)化細(xì)胞分割、RNA定位分配和斑點(diǎn)檢測和跟蹤方面的努力，將進(jìn)一步推動(dòng)我們目前對(duì)RNA定位的理解。除了擴(kuò)大mRNA種類的數(shù)量外，成像內(nèi)源性小RNA，如miRNA和RNA異構(gòu)體的能力將大大提高我們對(duì)亞細(xì)胞分辨率下的RNA生物學(xué)的理解。RNA的加工不僅涉及RNA，還涉及DNA和蛋白質(zhì)，將RNA成像與DNA和RBP成像相結(jié)合，將極大地提高我們對(duì)RNA生物學(xué)的理解，回答諸如染色體組織如何影響基因表達(dá)以及RNPs如何形成和組織等問題。此外，與高通量篩選研究的整合，如大規(guī)模RBP-RNA相互作用和CRISPR篩選，也將擴(kuò)展我們的工具箱，以探索多維度的RNA。圖3.RNA生物學(xué)多維方法的展望。

教授介紹：

Gene W. Yeo

Gene W. Yeo博士，是加州大學(xué)圣地亞哥分校（UCSD）的細(xì)胞和分子醫(yī)學(xué)教授，基因組醫(yī)學(xué)研究所的創(chuàng)始成員，UCSD干細(xì)胞計(jì)劃和摩爾斯癌癥中心的成員。Yeo博士是一位計(jì)算和實(shí)驗(yàn)科學(xué)家，為RNA生物學(xué)和治療學(xué)做出了貢獻(xiàn)。他的主要研究興趣是了解RNA加工的重要性以及RNA結(jié)合蛋白（RBP）在發(fā)育和疾病中的作用。他的實(shí)驗(yàn)室開創(chuàng)了人類疾病相關(guān)系統(tǒng)中的計(jì)算算法和實(shí)驗(yàn)方法，以進(jìn)行系統(tǒng)和大規(guī)模的研究。Yeo博士撰寫了160多篇同行評(píng)審的出版物，包括神經(jīng)變性，RNA處理，計(jì)算生物學(xué)和干細(xì)胞模型領(lǐng)域的特邀書籍章節(jié)和評(píng)論文章；并擔(dān)任兩本關(guān)于RNA結(jié)合蛋白生物學(xué)的書籍的編輯。
參考文獻(xiàn)：
Le, P., Ahmed, N. & Yeo, G.W. Illuminating RNA biology through imaging. Nat Cell Biol 24, 815–824 (2022).

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